紫心甘薯多糖的分离及组分抑癌活性研究的论文

　　天然活性多糖是一类结构复杂的生物大分子物质，作为植物细胞壁的结构成分广泛存在于自然界中，具有机体免疫调节、抗氧化、降血糖血脂等作用近年来，多糖研究日益受到人们的关注。目前，实验室常用热水浸提和低温碱提两种方法来获得天然活性多糖，如香菇多糖,海藻多糖等M。已有研究表明，采用热水浸提所得的天然植物多糖（如人参多糖）经纯化在体内外均具有一定的抗肿瘤活性0,也有报道紫心甘薯水提粗多糖在体内有一定的抑瘤效果,但尚未见到关于紫心甘薯多糖分离及组分抑癌研究的相关报道。本研究结合浙江省临安市太阳镇紫心甘薯基地的开发课题，以紫心甘薯“渝紫263”为材料,通过低温碱提获得紫心甘薯粗多糖,研究紫心甘薯多糖组分的分离条件,并借助体外细胞实验和红外光谱等检测手段初步探究紫心甘薯多糖的结构成分及组分的抑癌作用，为进一步开发和利用紫心甘薯提供理论指导和实验依据。

1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验材料与试剂紫心甘薯，由浙江省临安市太阳镇紫心甘薯实验基地提供;肿瘤细胞株Hela、HepG:,由浙江大学医学院提供；DEAE-Cellulose,华东医药试剂；CM-Cellulose,华东医药试剂；SephacrylS-t00,美国GE公司;D-葡萄糖醛酸，国药集团试剂；咔唑，中国远航试剂;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培养基，Hyclone公司；MTT,Sigma公司（临用时用PBS配置成5mg/ml溶液，分装避光-20°C保存）；DMSO,Sigma公司；

　　标准单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、NaCl、苯酚、浓硫酸、甲苯胺蓝等试剂均为国产分析纯。

　　1.1.2主要仪器AKTAprimeplus层析系统，美国GE公司；LDR44.4C低速冷冻离心机，北京医用离心机厂；高速冷冻离心机,BECKMANCOULTER；可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；RE-2000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；电子天平，德国IKA;磁力搅拌器，IKARHbasicl;红外光谱仪470FT-IR,NEXUS公司；倒置显微镜，OLYMPUS；二氧化碳培养箱，美国FormaScientific公司；516MC酶标仪，国产;各种尺寸层析柱，上海华美实验仪器厂;薄层层析硅胶板,浙江台州；真空干燥装置,上海一恒科技有限公司；层析缸，国产。

　　1.2方法

　　1.2.1紫心甘薯多糖提取参见文献0。甘薯洗净、去皮、烘干后粉碎；用3倍体积95%乙醇于80C水浴中回流脱脂2h,重复一次，晾干后在70C水浴中水提2h,离心分离上清液,残渣重复操作一次;合并上清液，浓缩,三氯乙酸法除蛋白，用3倍体积85%乙醇沉淀多糖；无水乙醇、丙酮反复洗涤；将沉淀在低温下用10%NaOH以1:10的比例进行碱提，浓缩，蒸馏水透析48h;用3倍体积85%乙醇沉淀多糖；离心取沉淀，用无水乙醇反复洗涤；真空烘干后得PPSP粗多糖。

　　1.2.2多糖标准曲线绘制苯酚4硫酸法检测糖含量，以葡萄糖为标准单糖,绘制葡萄糖标准曲线;硫酸咔唑法检测糖醛酸含量，以葡萄糖醛酸为标准品,绘制糖醛酸含量测定标准曲线。1.2.3离子交换层析参见文献_。离子交换柱的选择：配置0.05mol/LPBS缓冲液（K2HPO4-CH2PO4),再用此缓冲液配置0.5mol/LNaCl溶液,用0.45^m纤维素微孔滤膜过滤，超声脱气30min。将处理好的DEAE~Cellulose和CM-Cellulose分别装柱（2.6X30cm),用3倍柱体积的缓冲液平衡。取PPSP粗多糖，用去离子水配置成5mg/ml的PPSP多糖溶液,分别上样10ml,待吸附30min后，用相同体积的去离子水分别洗脱,流速1ml/min,每管10ml收集,苯酚^硫酸法检测,记录并作洗脱曲线。

　　洗脱液pH的选择：选用上述吸附效果较好的柱子，取50mgPPSP粗多糖3份,分别溶于10ml的pH7.2、H7.6、H8.1和pH8.6的PBS缓冲液中，经0.45^m滤膜过滤，缓慢上样，吸附30min后，用200ml对应pH缓冲液洗脱，流速1.0ml/min,每管10ml,苯酚~硫酸法检测，记录并作洗脱曲线。

　　洗脱方式的选择：确定交换柱与pH缓冲体系之后，探究不同洗脱方式对PPSP洗脱效果的影响。取5mg/ml多糖溶液10ml,滤膜过滤,缓慢上样，吸附30min。先后分别用蒸馏水、0.05mol/LpH7.6的PBS缓冲液结合0.1、.3、.5mol/LNaCl分段洗脱。流速1.0ml/min,每管10ml,分别收集。苯酚~硫酸法测定,作洗脱曲线，合并主要峰，透析除盐，浓缩，冷冻烘干待用。

　　1.2.4多糖收集和检测利用美国GE公司蛋白纯化仪自动收集器收集离子交换层析的洗脱液,采用苯酚4硫酸法跟踪检测各PPSP多糖组分（od490),以管号为横坐标，吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线，收集同种多糖组分。双蒸水透析48h,每12h换一次水,磁力搅拌。透析完毕,冷冻干燥得各多糖组分。

　　1.2.5凝胶过滤层析将处理好的SephcrylS400装柱（屮2.6X30cm),用0.05mol/L的.NaCl平衡,流速0.5ml/min。上述分离得到的样品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，滤膜过滤后取5ml缓慢上样，用0.05mol/L的NaCl溶液150ml洗脱，流速0.5ml/min,每管5ml分部收集,苯酚4硫酸法检测,作洗脱曲线图。

　　1.2.6薄层层析样品处理:取紫心甘薯多糖样品，按多糖：硫酸=4:1的比例加入6mol/L的％SO4,密封90C水解6h,碳酸钡中和，离心去沉淀。取葡萄糖、糖醛酸、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖等标准单糖做同样处理。待硅胶板活化后，用毛细管进行点样。展层剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：乙酸:水=7:20:12:7:5;显色剂:苯胺4卩苯二甲酸。

　　1.2.7红外光谱鉴定取约1mg已纯化的PPSP多糖组分样品，与适量KBr粉末在白炽灯下干燥磨混均匀，压片机压片，采用傅里叶变换红外光谱仪在4000cm-1~400cm-1区间扫描。

　　1.2.8MTT法检测PPSP多糖组分对Hela和HepG2肿瘤细胞的体外抑制作用参见文献。取对数生长期的Hela和HepG细胞，分别用胰蛋白酶消化后接种于96孔板中。设置不同PPSP多糖组分浓度的实验组，将标准葡萄糖和PPSPI、PPSPn、PPSPM三种多糖组分临用前用PBS配置成终浓度为10、20、40、80^g/ml溶液,紫外灭菌。每个实验组的各浓度梯度组,每孔加上述多糖组分溶液20空白对照组加入相同体积的PBS,每组设4个复孔，置于37C,5%CO2培养箱培养。在加样后第24、8、96h时各取一块96孔板，加入20^lMTT溶液继续培养4h。小心吸尽培养液，加入200^lDMSO,震荡,使蓝紫色结晶物充分溶解,于490nm波长下测各孔吸光度。肿瘤细胞抑制率公式:抑制率IR(%)=(1-A实验组/A空白对照组）x100%。

　　1.3数据处理采用SPSS18.0进行数据处理和分析,实验数据取三次平均值,采用方差分析（F检验）,有显著差异时，再作共同对照t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。