治疗脑内疾病的必要途径需将药物靶向性输送入脑内。以脑靶向性的蛋白或多肽作为载体，可能会实现药物的脑靶向转运。我们实验室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide)，可携带核酸、蛋白等生物大分子入脑。脂质体是一种安全有效的药物递送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂质体内核中，在体内安全释出以发挥作用。此外，脂质体较易修饰，从而可使其具有靶向性和高效性。本研究将在脂质体表面的PEG链端连接RDP多肽，以具有抗肿瘤效果的天然植物提取物姜黄素为模型药物，研究该RDP修饰脂质体的脑靶向作用，从而可能为向脑内送脂溶性化合物以治疗脑部疾病，提供一种崭新的途径和方法。

1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　姜黄素，纯度>98%，购自美国Sigma公司;大豆卵磷脂、胆固醇，纯度>95%，均购自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000)，购自美国Nanocs公司;Cys-RDP，纯度>95%，购自上海吉尔公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均为色谱纯。

　　1.2 仪器

　　高效液相色谱仪(包含SPD-M20A检测器和LC-20AD泵)，购自日本岛津公司;激光粒度及zeta电位分析仪(NanoZS)，购自英国马尔文公司;生物质谱仪autoflexspeedMALDI-TOF/TOF，购自德国BrukerDaltonic公司;AB135-S电子分析天平，购自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮气吹干仪，购自上海八方世纪科技有限公司;XHF-D高速分散器，购自宁波新芝生物科技有限公司。

　　1.3 细胞株及培养体系

　　人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG(实验室冻存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培养基培养，置于37℃、5%CO2、饱和湿度下的培养箱内。隔天换液，待细胞密度长至80% ～90%时，按照1∶3的比例传代。传代时，加入消化液一定时间后去除，用培养基吹打成单个细胞悬液，取生长良好、活性大于98%的细胞进行后续实验。

　　1.4 实验动物

　　昆明小鼠80只，♂各半，体质量(20±2)g，购自于重庆滕鑫生物技术有限公司。小鼠饲养于西南大学药学院SPF小鼠饲养室，恒温、恒湿，自由进食、进水。

　　1.5 脂质体的制备和表征

　　1.5.1 导向化合物的合成

　　按照摩尔比2∶1的比例精密称取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20μL的N-甲基吗啉，置于4mL离心管中，在搅拌器中避光搅拌48h。取出反应液，置于透析袋(MW 3500)中，放入2L去离子水中透析48h后(每6h换水1次)，冷冻干燥，-20℃保存。

　　1.5.2 脂质体的制备

　　采用薄膜分散法分别制备姜黄素脂质体(CUR-L)和RDP修饰的姜黄素隐形脂质体(RDP-CUR-L)。按照处方量(Tab1)精密称取各种脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37℃减压旋转蒸发10min，使其成均匀的薄膜。然后加入1mL去离子水，37℃于水浴摇床中水化1h，形成悬浮液，间歇超声90s，得到澄清透明呈淡黄色乳光的脂质体溶液，并分别过100nm的膜使粒径分布均匀，4℃冰箱内保存。

　　1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例筛选

　　按上述脂质体制备方法制备一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含药靶向脂质体(DSPE-PEG-RDP分别为总摩尔量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L对U87MG细胞抑制率的影响。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化液消化后，调整细胞浓度为5×107·L-1，以每孔500μL(5000个/孔)接种于96孔板，培养24h贴壁后加入不同浓度的CUR-L和RDP-CUR-L，浓度依次为150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1，孵育48h后，弃去培养基，每孔加入浓度为5g·L-1的MTT(20μL)，37℃培养4h，弃去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色甲#颗粒，用酶标仪在波长为490nm下测定光吸收值(OD)。每组实验重复3次，每个样品做3个平行样。全部实验均设DMSO对照组。计算药物抑制率和对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)。药物抑制率/% =(1-OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD对照组)×100%1.5.4 脂质体粒径、电位、分散度测定 用激光粒度及zeta电位分析仪分别测定CUR-L和RDP-CUR-L的粒径、Zeta电位、分散度(PDI)。

　　1.5.5 脂质体包封率测定

　　采用透析破乳法，取用均质机处理过的CUR-L和RDP-CUR-L，每组实验分成两份(每份400μL)：一份用透析液透析6h后，收集脂质体部分，以10%的TritonX-100破乳，经HPLC测定包裹在脂质体内的药物浓度C;另一份直接破乳，经HPLC测定姜黄素得到C0，按照公式计算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

　　1.5.6 脂质体稳定性考察

　　取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成两个实验组，每组平行3次，分别于3、7、15、30、45、60d后肉眼观察脂质体溶液变化，HPLC测包封率。

　　1.5.7 体外释放度测定

　　采用动态透析法(dynam-icdialysis)，按中国药典2010版附录XC第三法(小杯法)测定释放度。精密量取制剂CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL，经释放介质稀释至3mL，装于透析袋内(截留分子质量为8000u)，两端扎牢，放入150mL释放介质中，释放介质为含有0.2%十二烷基硫酸钠的人工胃液，37℃ 下姜黄素在此释放介质中的溶解度为80mg·L-1，满足漏槽条件。37℃恒温水浴搅拌(转速为100r· min-1)。分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各个时间点取样0.3mL，并及时补充等温的相同体积空白介质。微孔滤膜过滤，按照HPLC方法检测姜黄素含量，并计算累积释药百分率(%)。

　　1.6 姜黄素悬浮液和脂质体的体内分布

　　1.6.1 色谱条件

　　C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器公司);流动相：乙腈∶4%冰醋酸(48∶52)，流速：1mL·min-1，检测波长：430nm，柱温：25℃。

　　1.6.2 样品预处理

　　将姜黄素溶解于1%羧甲基纤维素钠中，配制成浓度为1g·L-1的CUR混悬液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L浓度均为1g·L-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黄素30mg·kg-1的剂量于小鼠尾静脉注射给药。取昆明小鼠，禁食12h，尾静脉分别注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各个时间点分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑(每个时间点3只)，用生理盐水清洗后用滤纸吸干，剪碎，精密称重，加入1mL生理盐水，用组织匀浆器匀浆，加入1mL乙酸乙酯，涡旋3min，3000r·min-1离心10min，精密吸取上清液，再加入相同体积的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮气吹干，加入10倍体积的流动相，超声、涡旋使其充分溶解，过膜后进样。

　　1.6.3 方法学考察

　　专属性：取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各空白组织匀浆液0.3mL，样品处理后采用HPLC法分别进样测定空白样品、空白样品加内标及小鼠尾静脉注射给药后的样品。标准曲线：取小鼠空白组织匀浆液，精密加入姜黄素标准溶液，配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列浓度的样品溶液，样品处理后，以姜黄素的峰面积与样品中姜黄素的浓度(C)进行线性回归。回收率与精密度：配制低、中、高浓度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黄素质控样品，各5份，按“样品处理”项下方法处理，进样测定。以姜黄素的峰面积代入标准曲线方程，计算出姜黄素的浓度，与实际加入量比较，计算方法回收率，用以表示准确度;以相应低、中、高浓度的姜黄素对照品溶液直接进样，以质控样品中姜黄素峰面积与对照品溶液中姜黄素峰面积比较，计算提取回收率;1d内进样测定5次，连续测定5d，计算日内RSD和日间RSD。