2结果与分析

　　2.1多糖提取及标准曲线经碱提法获得紫心甘薯粗多糖,经计算其得率为31.72%;检测到样品中糖含量为55.4pg/ml,糖醛酸含量为

　　11.51^g/ml；实验得出葡萄糖标准曲线为：A=0.5C-0.005(R=0.9986),糖醛酸标准曲线为：A=0.0053C(R2=0.9991)。

　　2.2离子交换层析

　　不同类型弱离子交换柱选择在一定条件下，分别经DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱和CM-Cellulose弱阳离子柱父换洗脱，洗脱图见图1。图1(a)的洗脱峰基本对称,峰形较规则;相比之下，图1(b)的洗脱峰较宽，无对称性且分布不均匀。推测DEAE-Cellulose柱对PPSP多糖的选择吸附性要比CM-Cellulose柱好，因此本实验选用DEAE-Cellulose柱分离PPSP多糖。2.2不同pH缓冲液选择PPSP多糖经不同pH值的PBS缓冲液洗脱得洗脱图，见图2。多糖是一类多羟基聚合物，中性或酸性多糖容易在碱性条件下被弱阴离子交换柱吸附。从图

　　2(a)分析可知,pH7.2的缓冲液洗脱时并没有出现对称峰形,继续洗脱得到拖尾峰。图2(b)显示,pH7.6的缓冲液在洗脱体积为100ml时开始出峰,且峰形对称、均一、含量较大。结合图2(c)和图2(d)分析,洗脱液碱性条件(pH大于8.2)对PPSP多糖分离不利，因此PPSP多糖分离的最佳洗脱缓冲液pH值为7.6。

　　2.2.3洗脱方式优化在pH7.6的条件下,将PBS缓冲液结合NaCl溶液进行0~1mol/ml浓度范围的线性洗脱（图3)。可以看出，第一个PPSP多糖组分分离完全,但继续洗脱后并没有将剩余多糖组分很好地分离。推测线性洗脱时低盐浓度对PPSP的分离有效，高浓度盐溶液不适用于该多糖的分离。

　　与线性梯度洗脱相比较，分段洗脱更适用于不同多糖组分间的分离，峰形陡而尖且相对

　　完整,见图3。收集四个多糖组分吸收峰，分别命名为ppspI、ppspn、ppspm和ppspw。前三个多糖组分的含量相对较高，经过SephcrylS-400凝胶柱后得到了单一对称峰,纯度较好。

　　根据以上实验结果，本实验选用以下条件来进行PPSP多糖的离子交换色谱分离：弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose；在pH7.6的0.05mol/LPBS缓冲液（I(2HPO44CH2PO4)体系下,采用200mlPBS缓冲液、200ml0.1mol/LNaCl溶液、300ml0.3mol/LNaCl溶液和100ml0.5mol/LNaCl溶液进行分段洗脱。

　　1.3薄层层析结果完全酸水解的紫心甘薯多糖PPSPI、PPSPH、PPSP1,二次层析结果分析多糖组分的单糖组成为:PPSPI主要由葡萄糖和半乳糖组成，ppspn主要由葡萄糖组成;ppspm没有检测到结果，分析可能与其糖蛋白成分干扰有关。

　　2.4红外光谱结构分析ppsph的红外光谱图（图4):881cm-1的峰表明PPSPH中的糖苷键为P型（a型糖苷键的吸收峰在890cm-1左

　　右处）。1097cm-1和1041cm-1的吸收峰表在1384~1076cm-1具有明显特征吸收峰），示PPSPH中的糖环构型为吡喃型（呋喃型糖环表明PPSPH具有P~D-葡萄吡喃聚糖的特征吸收峰。

　　PPSP1的红外光谱图（图5)：在3422cm-1附近有O-H伸缩振动的强吸收峰，1630cm-1可能是~CHO中C=O的伸缩振动,这两组峰是多糖的特征吸收峰;1100cm-1可能是C4的弯曲振动峰,另外,在1425cm-1具有较弱的吸收峰，为蛋白质特征吸收峰。因此，推测ppspm可能为糖蛋白。

　　1.5多糖组分对肿瘤细胞株Hela和HepG:的体外抑制作用PPSPn组分对Hela和HepG2肿瘤细胞株的体外抑制效果如图6所示,PPSPH对Hela和HepG:细胞在体外具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖效应。从图6(a)中可看出，10ag/ml剂量组在48h时达到最大,然后

　　开始下降,20ag/ml和40ag/ml剂量组在24h时达到最大,80ag/ml剂量组受到强烈抑制,细胞数量一直下降。从图6(b)图中可以看出,PPSPn组分

　　41.83%,61.45%,68.67%(P<0.01)。图6(c)中显示，不同浓度的ppspn组分作用下,20ag/ml,40ag/ml,80ag/ml剂量组均在48h时细胞活力达到最大，然后开始下降。从图6(d)中可看出，PPSPH组分对HepG2细胞株在96h时均有较高的抑制率,分别为30.76%,36.83%,42.46%,48.53%(P<0.01)。

　　PPSP1组分对Hela和HepG2肿瘤细胞株的体外抑制效果如图7所示,PPSP1对Hela和HepG2细胞在体外具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖效应。从图7(a)中可看出,20ag/ml和40ag/ml剂

　　量组在48h时细胞活力达到最大,80ag/ml剂量组在24h时细胞活力达到最大,然后开始下降。从图7(b)中可以看出,40ag/ml剂量组在48h和96h的抑制率分别为34.50%和42.07%(P<0.05),80ag/ml剂量组在48h和96h时的抑制率分别为42.81%(P<0.05)和54.13%(P<0.01)。从图7(c)中显示，20ag/ml'40ag/ml'80ag/ml剂量组均在48h时细胞活力达到最大,然后开始下降。从图7(d)中可得,40ag/ml剂量组在96h时抑制率为54.68%(P<0.05),80ag/ml剂量组在24h、48h和96h时抑制率分别为33.15%(P<0.05),41.86%(P<0.05)和71.08%(P<0.01)。

　　同时,本实验在设计了PBS溶液作为空白对照组以外，还选取标准葡萄糖溶液作为实验参考。实验发现:加入标准葡萄糖溶液后，Hela和HepGi肿瘤细胞的生长趋势与空白对照组相似,且相应同浓度的标准葡萄糖对两种肿瘤细胞的抑制不明显，不存在剂量依赖效应。

　　3讨论

　　本实验以浙江省临安市太阳镇紫心甘薯“渝紫263”为研究对象,低温碱提法获得紫心甘薯多糖，在比较了ppsp多糖的弱阳离子和弱阴离子交换柱的洗脱分离效果后，选用DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱进行分离，获得了4个多糖组分（PPSPI、PPSPn、PPSPM和PPSP^)。据国外研究报道13,中性多糖和酸性多糖常通过弱阴离子交换柱进行分离,低盐浓度下洗脱得到中性多糖，而高盐浓度下洗脱的多为酸性多糖；中性多糖可以进一步经凝胶过滤层析被分离成a-葡聚糖（吸附较强）和p肩聚糖（吸附较弱）。本实验中发现,ppspI在低盐浓度下最先被洗脱出来，且经检测不含糖醛酸,推测PPSPI为中性多糖组分,PPSPH、PPSPM和PPSPW随后被洗脱分离，推测为酸性多糖。紫心甘薯多糖组分的体外抑癌实验结果表明，酸性多糖PPSPH和PPSPM在体外对Hela和HepGi肿瘤细胞株生长有一定的抑制作用，而中性多糖PPSPI无明显的抑制效果。以上结果与文献报道的天然活性多糖中酸性多糖对癌细胞生长有较明显抑制效果的观点相符M。

　　多糖组分的结构与其生物活性之间的关系一直是研宄的热点和难点。天然活性多糖中含有丰富的中性多糖和酸性多糖，单糖间以糖苷键相连,有些单糖与蛋白质或脂质相连,构成糖蛋白或糖脂，这些不同的连接方式赋予了天然活性多糖抗肿瘤活性的良好结构基础&443。本实验从PPSP多糖对肿瘤细胞体外抑制实验结果中初步表明“渝紫263”中所含的天然活性多糖中的PPSPH和PPSPM组分具有一定的体外抑癌活性，分析可能与它所含有的P~D-葡萄吡喃聚糖和糖蛋白成分有关。目前PPSPH、PPSPM组分的构效分析仍在深入研究中。

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