生物正交氧化还原体系的构建及意义论文(2)
时间：2021-08-313 生物正交氧化还原体系
空间正交氧化还原体系通过限制环境因素对体系的影响提高催化效率和可控性， 仍然难以避免天然辅因子与底盘细胞中天然代谢网络的相互影响。如果突破相应生物化学反应对天然辅因子的依赖，建立生物正交氧化还原体系， 将可能从根本上解决能量特异性传递问题。
3.1 生物正交氧化还原体系构建
构建生物正交氧化还原体系， 需要合成不被天然代谢系统识别的人工辅因子， 并获得特异性识别人工辅因子的突变型酶， 组成具有催化功能的配对[15,33].利用蛋白工程和化学生物学方法， 构建独立于天然生物反应的非天然配体/受体配对， 即生物正交体系，已取得过一些降低生物体系复杂度的成功例子[34,35].
生物正交的配体/受体配对设计策略可分为两种： （ⅰ）策略以配体改造为中心， 即先改造受体并筛选获得不识别天然配体的新受体， 再合成具有一定结构多样性的配体类似物文库， 然后筛选得到该新受体与特定配体类似物配对的功能组合； （ⅱ） 策略以受体改造为中心， 即先选定一种不被天然受体利用的配体类似物， 再构建受体文库， 然后筛选得到该配体类似物与新受体的配对功能组合[36].
以设计筛选 NAD 类似物-依赖型氧化还原酶为例， 说明正交氧化还原体系构建过程[33]. 对于 NAD分子， 可认为由单磷酸腺苷（adenosine monopho-sphate, AMP） 和 烟 酰 胺 单 核 苷 酸 （nicotinamidemononucleotide, NMN） 两部分组成 （ 图 2A）， 其中NMN 参与电子传递， 而 AMP 部分参与分子识别， 对辅因子特异性有重要影响[37]. 改造 NAD 结构的腺嘌呤环部分， 可在保留电子传递功能的同时改变其与受体相互作用。 因此， 以其他杂环代替腺嘌呤环部分合成一系列 NAD 类似物， 同时以 NAD 依赖型苹果酸酶（malic enzyme, ME）为例构建其突变体表达文库。 利用以上合成的特定NAD类似物为辅因子， 筛选ME突变体文库， 得到具有催化活性的功能配对[33,38,39].
以 5-氟代胞嘧啶环代替腺嘌呤环的类似物烟酰胺 氟 代 胞 嘧 啶 二 核 苷 酸 （nicotinamide flucytosinedinucleotide, NFCD）（图 2B）为辅因子， 野生型 ME 催化效率仅为以 NAD 为辅因子时的 0.93%. 在 ME 突变 文 库 中 筛 选 利 用 NFCD 的 突 变 体 ME*（MEL310R/Q401C）， ME*以 NFCD 为辅因子的催化效率与野生型组合相当， 而以 NAD 为辅因子的催化效率仅为以 NFCD 为辅因子的 0.37%. 而且， ME*保留了对底物苹果酸的立体选择性。 因此， ME*-NFCD 组合可 作 为 生 物 正 交 化 氧 化 还 原 体 系 执 行 天 然 的ME-NAD 体系的催化功能[33]. 进一步合成了其他NAD 类似物（图 3B）， 发现 ME*与 NBrCD 配对的催化效率可达到野生型配对催化活性的 73%. 表明 NAD类似物与 ME*组成的配对可达到与天然体系相近的催化效率， 即构建了不依赖天然辅因子的正交氧化还原体系[39].
基于NFCD类似物（NFCD analog, NXCD）的正交氧化还原体系构建策略具有可扩展性。 氧化还原酶与 NAD 的结合区域通常具有保守的 Rossmann 折叠结构[40]. ME*的关键突变位点 L310 位于其保守序列GX（X）GXXG 的 N-末端， 对苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的相应保守位点的氨基酸进行定点突变， 均获得了偏好 NFCD 的突变体[33]. 说明同样的突变策略可应用于改造其他吡啶核苷酸辅酶依赖型氧化还原酶， 构建相应的正交反应体系。
构建生物正交氧化还原体系的难点在于设计筛选生物正交的配体-蛋白组合。 虽然不断完善的配体-蛋白组合辅助设计工具降低了工作难度[41~43], 获取高活性配体-蛋白组合仍需高通量筛选策略[44]. 由于氧化还原酶具有较高的结构保守性[40], 识别 NAD 类似物所蕴涵的信息可用于指导改造其他氧化还原酶。 目前使用的 NXCD 系列类似物合成成本较高， 使用过程中可以选择循环再生策略降低使用成本[33].
3.2 生物正交氧化还原体系的应用
由于正交氧化还原体系独立于天然辅因子循环体系， 可进行途径特异性还原力传递， 因此理论上可用表达突变型功能酶的粗酶液进行选择性生物转化。
以大肠杆菌细胞裂解液催化转化苹果酸生产丙酮酸为例， 对于表达野生苹果酸酶的体系， 在 NAD 存在下， 苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸并伴生NADH[45]. 而内源的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）以NADH 为辅因子， 进一步将丙酮酸还原为乳酸（图3A）。 丙酮酸和乳酸收率分别为 70%和 26%, 即 26%丙酮酸被转化成乳酸。 而利用过表达 ME*的粗酶液在外加 NFCD 的条件下， 丙酮酸收率达到 79%时， 乳酸收率仅为 5%. 这是因为， 内源乳酸脱氢酶难以利用 NFCDH 为辅因子还原丙酮酸（图 3B）。
可见， 利用生物正交氧化还原体系， 可以使电子特异性地在该体系内部传递， 避免与内源途径相互干扰， 提高体系效率的同时排除副反应。 这一特性表明正交氧化还原体系可降低外源途径与底盘细胞中天然代谢网络的相互干扰， 提高外源合成途径与底盘细胞适配性。 由于目前还没有在胞内检测到NXCD 的相关报道， 应用正交氧化还原体系需要解决将 NXCD 导入胞内的问题。 通过化学合成获得NXCD, 再利用细胞透性化技术或转运蛋白[48~50]可将 NXCD 导入细胞。
作者近期利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）来源的 NAD 转运蛋白[50]将胞外 NCD 导入大肠杆菌工程菌， 成功地在胞内构建生物正交氧化还原体系[51]. 该体系利用突变型亚磷酸脱氢酶氧化亚磷酸再生NCDH, NCDH 特异性推动 ME*催化丙酮酸还原羧化产生苹果酸[51,52]. 而对于天然体系， 由于 NADH 被天然代谢系统消耗， ME利用NAD催化苹果酸氧化脱羧反应。 这些结果表明， 基于 NCD 的正交体系可有效避免与天然体系相互干扰， 选择性传递氧化还原力。正交氧化还原体系的应用将显着提高外源合成途径与底盘细胞适配性。
4 展望
正交氧化还原体系对提高辅因子调控效率和可预见性具有重要意义， 有利于提高外源合成途径与底盘细胞适配性。 可通过空间正交化和生物正交化两种策略构建正交氧化还原体系。 其中空间正交化策略在空间上隔离辅因子依赖型代谢反应， 其推广应用依赖于发现更高效的蛋白锚定支架系统或组装新的微区室。 生物正交化策略可从根本上解决辅因子依赖型反应相互干扰的问题， 是辅因子调控技术发展的重要方向， 其发展依赖于分子间相互作用的分析设计能力和配体/受体组合的筛选能力， 以获得功能更丰富的生物正交氧化还原体系， 并提高生物正交特异性。 其中在 NCD 基础上设计烟酰胺胞嘧啶二 核 苷 酸 磷 酸 （nicotinamide cytosine dinucleotidephosphate, NCDP）化学合成或生物合成途径， 并筛选构建 NCDP-功能酶正交组合， 将极大地提高生物正交氧化还原体系组件的设计构建效率， 提供多种辅因子水平和氧化还原状态选择， 为基于生物正交氧化还原体系的代谢途径设计提供更广阔的应用和研究空间。
正交氧化还原体系提供了一种提高胞内辅因子调控效率和可预见性的新思路， 与其他工程策略组合使用， 对设计微生物细胞工厂乃至生命系统具有重要价值。 参考文献
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