开口箭活性部位抗肿瘤细胞作用研究论文

时间:2021-08-31

  1 材料与仪器

  1.1 细胞株人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(HepG2)均由三峡大学分子生物学研究所提供。

  1.2 药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品;新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品;HEPES为美国Sigma公司产品;胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品;四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品;环磷酰胺 (CP,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:07020121)。酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN);CO2培养箱(日本三洋公司);LD4-2A离心机(北京医用离心机厂);96孔板(美国Cornning公司)。开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区,经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.,标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室(No.TC200207SNJ)。

  2 方法

  2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后,用甲醇回流提取,合并提取液,浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取,旋转蒸发回收正丁醇,浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷,配成水液,过大孔树脂柱,水洗, 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱,得开口箭4部分皂苷。分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品,用PBS配制成所需浓度,依次为312.5,625,1 250,2 500,5 000,10 000 μg/ml, 70%开口箭皂苷用PBS配制成所需浓度,依次为156.25,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/ml,所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 (CP)用DMSO将其配置为500 mg/ml。

  2.2 细胞培养 Hela和HepG2细胞用RPMI-1640培养液(另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清),于CO2孵箱中37℃,5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

  2.3 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择MTT法实验条件的初步优化,主要是对溶解药物的溶剂(水、PBS)、加药前的培养时间(6,12,24 h)、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100 μl,转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位,继续培养48 h,以MTT法测定吸光度,比较不同细胞密度的线性关系。

  2.4 MTT比色法[6]MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液,调整细胞浓度为0.5×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100 μl,转板24 h后加100 μl受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白调零组(只有PBS)和阳性对照组(环磷酰胺组),每组均设3个复孔,培养48 h,吸弃上清后加MTT(5 mg/ml)100 μl,继续培养4 h后,弃去上清液,加DMSO 100 μl,用全自动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度(OD)值[7],求出IC50。抑制率(%)=[阴性对照A570- 加药组A570]/ 阴性对照A570×100%。

  2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶,阴性对照组0.5×106个细胞每瓶,培养24 h;吸弃部分上清后加药混匀(开口箭总皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml,70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml),继续培养48 h;于5%CO2培养箱中培养48 h后,收集上清于相应标签离心管中,各加1 ml胰酶消化,加4 ml培养液于该培养瓶中,并一起吸至各相应离心管中,各瓶加入5 ml PBS洗涤,洗涤液一起吸入相应离心管中,以2 000 r/min离心5 min;吸弃上清,加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA(Na)2的PBS混合液悬起细胞,轻轻混匀,于4℃固定30 min;弃上清,加PBS 10 ml混匀,以2 000 r/min离心5 min;用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS悬起细胞,转置测定管中,加溴化丙锭PI 100 μl,避光染色17 min(一般15~20 min);滤膜过滤后上机。

  3 结果

  开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的'选择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果,通过前期预实验并结合大量资料,对该MTT法实验条件进行了初步优化,主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂,最初采用的溶剂是水,通过对照发现溶解药物的水对细胞的影响很小,但并非没有,所以正式实验采用PBS溶解药物;对于加药前的培养时间采用了6,12,24 h 3个时间,通过显微镜观察发现加药前培养24 h细胞状态良好,由此选用了加药前培养24 h;

  对于药物剂量,通过多次预实验,最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml,70%皂苷为5 000 μg/ml,而环磷酰胺为20 000 μg/ml;对于细胞密度,通过多次预实验,采用5种细胞密度即0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105个/ml,同样的药物浓度情况下,开口箭活性部位对Hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度是0.5×105 个/ ml,由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化,从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响;而且这两种肿瘤细胞的MTT实验在同一批进行实验,排除了不同环境的干扰,从而得出实验结果。

【开口箭活性部位抗肿瘤细胞作用研究论文】相关文章:

1.关于染料木素抗肿瘤作用分析论文

2.抗肿瘤血管生成药物研究的弊端论文

3.国际软法作用研究论文

4.抗肿瘤药物职业危害风险管理研究论文

5.会计监督作用研究论文

6.生活满意度的中介作用研究论文

7.有关工程化的神经干细胞的研究进展论文

8.论文的作用