复方六月雪（CLYX）是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方，主要由广西民间草药六月青、白花蛇舌草、栀子花根等组成，本课题组前期大量的实验研究表明，该方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒DNA 和HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制［2，6，8］；无毒浓度的CLYX在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBV DNA的复制及HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）的分泌［3，7］；此外，CLYX对CCl4、AP、D-Gal所致小鼠急性化学性肝损伤均有明显的保护作用，并由此推测其保肝作用可能与诱导肝药酶有关［4］。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物六月青总皂苷，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。

　　1.2 动物Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（250±10）g，由广西医科大学实验动物中心提供。

　　1.3 细胞株HepG2.2.15细胞株，购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所，本室自行传代，定期用G418筛选。

　　1.4 试剂阿昔洛韦（Aciclovir ACV）：湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号： 20070518；RPMI1640培养基：美国Gibco公司，Cat№21202-016；胎牛血清：美国Gibco公司，Cat№21607-042；G418：美国Sigma公司，Cat№228527-72；HBV DNA荧光定量PCR试剂盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613。

　　1.5 仪器iCycler FQ实时荧光定量PCR仪：美国Bio-Rad公司；CO2孵箱：美国Thermo Forma公司，Model311。

　　2 方法

　　2.1 六月青总皂苷的`制备六月青粗粉1.0 kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5 h/次，减压回收乙醇至无醇味，分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，弃去有机溶剂萃取液，最后再用水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩至干，得到41.28 g浸膏，上处理好的AB-8型大孔树脂柱（40 mm×800 mm），分别用6BV的30%乙醇和50%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压回收乙醇， 60℃的减压恒温干燥箱中干燥得4.28 g淡黄色化合物，经常规化学定性试验证实为皂苷类，利用香草醛-硫酸分光光度法测定总皂苷含量［5］，纯度为85.8%。

　　2.2 TLYQ含药血清的制备3月龄Wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只。①空白对照组：予等量的生理盐水；②阳性对照组：ACV 0.1×10-3 g·kg-1·d-1；③TLYQH组：28.2×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药6.6 g. kg-1·d-1）；④TLYQM组：14.1×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药3.3 g·kg-1·d-1）；⑤TLYQL组：7.1×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药1.7 g·kg-1·d-1）。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃ 30 min灭活处理，经0.45 μm的微孔滤膜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。

　　2.3 荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测HBV DNA取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104 cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900 μl，置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24 h后，分别加入各组含药血清100 μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌Eppendor管中， -20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌Eppendorf管中， -20℃保存，统一待检。 按试剂盒方法提取样品HBV DNA。HBV DNA定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1 min，95℃变性5 s，60℃退火、延伸20 s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。

　　3 结果

　　药复方成分非常复杂，其组方配伍多数是以某一味药为主其余为辅，诸药发挥协同治疗作用。为了能更好地保证CLYX疗效稳定性，本研究对该方中的君药（六月青）进行研究，即从六月青提取分离出总皂苷活性部位，并对其进行抗HBV药效学研究，筛选出该方有效活性部位，进而为下一步分离纯化有效化学成分，建立处方质控标准提供实验依据。是六月青主要活性部位之一。

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